Implementación de un míºltiplex PCR para el diagnóstico del vibrio cholera, en el control de calidad de camarón de exportación
DOI:
https://doi.org/10.23857/dc.v4i3%20Especial.568Palabras clave:
, Genes, Multiplex – PCR, Diagnostico, Toxina, Vibrio choleraResumen
El objetivo del presente trabajo, es implementar la técnica de Multiplex- PCR para el diagnóstico en forma simultónea de los genes de toxina de Vibrio cholera, aislados a partir de muestras de Litopenaeus vannamei, evaluar este diagnóstico en situaciones de control epidemiológico y de control de calidad. Se usaron muestras de bacterias en medio de cultivo sólido y en caldos pre-enriquecidos para evaluar eficiencia mediante comparaciones de protocolos de miniprep de purificación fenol/cloroformo/isoamil alcohol, y método rópido para evitar usar fenol/cloroformo/isoamil alcohol; se emplearon iniciadores específicos de genes marcadores de virulencia, y se optimizaron las condiciones de amplificación de la Simple y Multiplex -PCR para la detección de Vibrio cholera. Se logró optimizar un multiplex PCR para la detección de Vibrio cholera empleando iniciadores para 4 genes de virulencia (ctxA, toxR, tcpA e hlyA) la cual después de optimización es capaz de detectar ctxA e hlyA en las diluciones 10-7 mientras que para los genes toxR y tcpA hasta la dilución 10-8, la cual basada en su sensibilidad se puede sugerir su uso como sistema de monitoreo sensible de productos acuícolas para determinar la inocuidad frente a este patógeno.
Citas
Aguirre-Guzmán G. and Ascencio-Valle F. 2000. Infectious disease in shrimp species with aquaculture potential. Resent Research. Development Microbiology, 4:333-348.
Albert MJ, Bhuiyan NA, Talukder KA, Faruque AS, Nahar S, Faruque SM, Ansaruzzaman M, Rahman M. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholera O139 Bengal. J Clin Microbiol. 1997 35(10):2588-92.
Dalsgaard, A. 1998. The occurrence of human pathogenic Vibrio spp. and Salmonella in aquaculture. International Journal of Food Science and Technology, 33: 127-138.
Faruque SM., Albert MJ., and Mekalanos JJ. Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol Mol Biol Rev 62 (4):1301-14, 1998.
Faruque SM., Asadulghani, Abdul ARM, Albert M.J., Nasirul Islam K.M., and Mekalanos JJ. Induction of the lysogenic phage encoding cholera toxin in naturally occurring strains of toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139. Infection and Immunity 66 (8):3752-3757, 1998
Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., and Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J Clin.Microbiol 30 (8):2118-2121, 1992.
Gubala A.J. and Proll D.F. Molecular-beacon multiplex real-time PCR assay for detection of Vibrio cholerae. Appl Environ Microbiol 72 (9):6424-6428, 2006.
Gubala AJ. Multiplex real-time PCR detection of Vibrio cholerae. Journal of Microbiological Methods 65 (2):278-293, 2006.
Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., Basu A., Bhattacharya S.K., Nair G.B., Shimada T., and Takeda Y. Development and evaluation of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139. FEMS Immunology and Medical Microbiology 20 (3):201-207, 1998.
Jin D., Xiao-Jing Xu, Su-Hong Chen, Si-Yuan Wen, Xue-En Ma,Zheng Zhang, Feng Lin and Sheng-Qi Wang. (2007) Detection and identification of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and Vibrio cholerae O139 using oligonucleotide microarray. Infectious Agents and Cancer, 2:23.
Kapley A, Purohit HJ. Detection of etiological agent for cholera by PCR protocol. Med Sci Monit. 2001 Mar-Apr;7(2):242-5.
Keasler, S. P., and R. H. Hall. 1993. Detecting and biotyping Vibrio cholerae O1 with multiplex chain reaction. Lancet. 341:1661
Kong R.Y., Lee S.K., Law T.W., Law S.H., and Wu R.S. 2002. Rapid detection of six types of bacterial pathogens in marine waters by multiplex PCR. Water Res 36 (11):2802-12.
Lipp E.K., Rivera I.N.G., Gil A.I., Espeland E.M., Choopun N., Louis V.R., Russek-Cohen E., Huq A., and Colwell R.R. Direct detection of Vibrio cholerae and ctxA in Peruvian coastal water and plankton by PCR. Applied and Environmental Microbiology 69 (6):3676-3680, 2003.
Lyon WJ. TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and non-O139 in pure cultures, raw oysters, and synthetic seawater. Appl Environ Microbiol 67 (10):4685-93, 2001.
Oliver, J.D. and Kaper, J.B. 1997. Vibrio Species. In M.P. Doyle, L.R. Beuchat and T.J. Montville, eds.Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, p228-264. Washington, D.C., ASM Press.
Rivera I.N., Chun J., Huq A., Sack R.B., and Colwell R.R. 2001. Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae. Appl.Environ.Microbiol 67 (6):2421-2429.
Shangkuan, Y. H., Y. S. Show, and T. M. Wang. 1995. Multiplex polymerase chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae and to biotype Vibrio cholerae O1. J. Appl. Bacteriol.79:264–273.
Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A., Mukhopadhyay AK., Basu A., Mitra R., Basu I., Bhattacharya SK., Shimada T., Ramamurthy T., Takeda T., Yamasaki S., Takeda Y., and Nair GB. Molecular analysis of non-O1, non-O139 Vibrio cholerae associated with an unusual upsurge in the incidence of cholera-like disease in Calcutta, India. Journal of Clinical Microbiology 36 (3):756-63, 1998.
Singh D.V., Isac S.R., and Colwell R.R. Development of a hexaplex PCR assay for rapid detection of virulence and regulatory genes in Vibrio cholerae and Vibrio mimicus. Journal of Clinical Microbiology 40 (11):4321-4324, 2002.
Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B.N., Sanyal S.C., Huq A., and Colwell R.R.. Molecular analysis of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and non-O139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates. Appl Environ Microbiol 67 (2):910-21, 2001.
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